藍(lán)色熒光染色體核型分析試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

藍(lán)色熒光（DAPI）染色體核型分析試劑是一種旨在通過使用熒光染料DAPI與染色體DNA的結(jié)合并發(fā)出熒光檢測信號來顯示染色體帶型特征而構(gòu)成細(xì)胞染色體核型的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。該熒光分析是細(xì)胞遺傳學(xué)中的新研究技術(shù)。適用于各種生長中的動物或人體細(xì)胞。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

技術(shù)背景

作為細(xì)胞DNA染色劑之一的4,6-二咪基－4-聯(lián)苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole； DAPI）特異性地與DNA雙螺旋的凹槽部分發(fā)生相互作用，從而與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好是UV（紫外光）的激發(fā)波長356nm，使得DAPI成為了一種常用的熒光檢測信號。通過DAPI的染色顯示其帶型特征，然后根據(jù)體細(xì)胞中全套染色體形態(tài)特征和大小順序排列，并依次配對、分組，構(gòu)成該個體的核型或染色體組型，從而可以識別和分析染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的異常，成為產(chǎn)前診斷或腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)的工具。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）                  毫升

滯態(tài)液（Reagent B）             毫升

低滲液（Reagent C）             毫升

固定液A（Reagent D）             毫升

固定液B（Reagent E）             毫升

預(yù)備液（Reagent F）             毫升

染色液（Reagent G）              毫升

抗淬滅劑（Reagent H）               毫升

產(chǎn)品說明書                           1份

保存方式

保存滯態(tài)液（Reagent B）和染色液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；滯態(tài)液（Reagent B）、染色液（Reagent G）和抗淬滅劑（Reagent H），避免光照，有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液：用于細(xì)胞培養(yǎng)

無離子水：用于清洗染色的載玻片

50毫升錐形離心管：用于細(xì)胞處理的容器

37℃恒溫水槽：用于預(yù)熱試劑溶液

臺式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

小型染色缸：用于載玻片染色的容器

載玻片：用于細(xì)胞涂片和染色

顯微鏡：用于觀察細(xì)胞分裂和染色體組型

實驗步驟

實驗開始前，將試劑盒里的固定液A（Reagent D）和B（Reagent E）從4℃的冰箱里取出，移取A液xx毫升和B液xx毫升加入到50毫升錐形離心管，混勻后標(biāo)記成為固定工作液，置入冰槽里。同時在37℃恒溫水槽里預(yù)熱清理液（Reagent A）、滯態(tài)液（Reagent B）、低滲液（Reagent C）。然后進(jìn)行下列操作。

一、 限定細(xì)胞在有絲分裂中期（METAPHASE）

1）貼壁細(xì)胞處理

1． 抽去鋪滿生長細(xì)胞的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液

2． 加入xx毫升 清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，

3． 小心抽去清理液（Reagent A）

4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面

5． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育3分種

6． 手擊振動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

7． 加入15毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液，充分混勻

8． 移出10毫升混勻物到新的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶

9． 加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液到上述新的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶

10． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育16至20小時

11． 小心抽去鋪滿70％生長細(xì)胞的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液

12． 加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液

13． 加入xx微升37℃預(yù)熱的滯態(tài)液（Reagent B），輕輕搖動細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使其混勻

14． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，孵育2小時

15． 在顯微鏡觀察下，細(xì)胞開始收縮變圓，表明細(xì)胞處于有絲分裂

16． 手擊振動拍打培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

17． 移出含有滯態(tài)液（Reagent B）的細(xì)胞培養(yǎng)液到50毫升錐形離心管

18． 加入xx毫升清理液（Reagent A）到培養(yǎng)瓶，清洗整個細(xì)胞表面

19． 移出清理液合并到50毫升錐形離心管

20． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面

21． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種

22． 手擊振動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

23． 加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液，充分混勻

24． 移出混勻物合并到50毫升錐形離心管

25． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

26． 小心抽去上清液（保留0.3毫升）

27． 手指輕彈混勻細(xì)胞

2）懸浮細(xì)胞處理

1． 準(zhǔn)備好10⁸懸浮細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等）

2． 移入到50毫升錐形離心管

3． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘， 速度為300g

4． 小心抽去上清液

5． （選擇步驟）加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻顆粒群

6． （選擇步驟）放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘， 速度為300g

7． （選擇步驟）小心抽去清理液（Reagent A）

8． 加入15毫升用戶自備的RPMI 1640*細(xì)胞培養(yǎng)液，充分混勻細(xì)胞顆粒群

9． 轉(zhuǎn)移到到新的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶

10． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育16至20小時

11． 移入到50毫升錐形離心管

12． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘， 速度為300g

13． 小心抽去上清液

14． 加入10毫升用戶自備的RPMI 1640*細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻細(xì)胞顆粒群

15． 加入xx微升37℃預(yù)熱的滯態(tài)液（Reagent B），混勻

16． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，孵育2小時

17． 在顯微鏡觀察下，細(xì)胞開始收縮，表明細(xì)胞處于有絲分裂

18． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘， 速度為300g

19． 小心抽去上清液

20． 加入10毫升用戶自備的RPMI 1640*細(xì)胞培養(yǎng)液，充分混勻

21． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

22． 小心抽去上清液（保留0.3毫升）

23． 手指輕彈混勻細(xì)胞

二．低滲處理有絲分裂細(xì)胞

1． 用滴管一滴一滴加入xx毫升37℃預(yù)熱的低滲液（Reagent C）到50毫升錐形離心管，輕輕搖動

2． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育15分鐘

3． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

4． 小心抽去上清液（保留0.3毫升）

5． 手指輕彈混勻細(xì)胞

三．固定細(xì)胞

1．用滴管一滴一滴加入xx毫升預(yù)冷的固定工作液到50毫升錐形離心管，輕輕搖動

2．放進(jìn)冰槽里孵育至少5分鐘

3．放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

4．小心抽去上清液（保留0.3毫升）

5．手指輕彈混勻細(xì)胞

6．重復(fù)上述步驟1至5，直到沉淀細(xì)胞顆粒群為白色（越白越好）

7．加入5毫升固定工作液到50毫升錐形離心管，充分混勻

四．染色體載片制作

1． 先將載玻片置于冰箱里冷卻，然后放在實驗臺上，并排放上5至10張

2． 從高達(dá)30至60厘米處向下滴上3滴細(xì)胞混勻液在載玻片上，立即吹散開，使其散開或然后拿起載玻片，輕輕拍擊手掌（注意：參見注意事項8）

3． 在顯微鏡下觀察有絲分裂中期的細(xì)胞

4． 空氣中晾干載玻片（注意：參見注意事項8）

5． 可以保存在70％酒精里，放進(jìn)4℃冰箱長達(dá)一年。剩下的在固定液里的細(xì)胞可以長期保存在－20℃冰箱里

五．染色

1． 加入xx毫升預(yù)備液（Reagent F）到小型染色缸（Coplin jar）

2． 放進(jìn)晾干的載玻片孵育30秒

3． 取出載玻片，加上xx微升染色液（Reagent G），鋪滿整個細(xì)胞表面

4． 置入暗室3分鐘

5． 放進(jìn)含有預(yù)備液（Reagent F）的小型染色缸孵育30秒

6． 取出載玻片，用用戶自備的無離子水輕輕沖洗3次

7． 在暗室里晾干

8． 加上xx微升抗淬滅劑（Reagent H）

9． 封片

10． 在熒光顯微鏡紫外波長下，觀察呈現(xiàn)藍(lán)色的細(xì)胞染色體

11． 將熒光圖像轉(zhuǎn)換為黑白圖像，顯示G帶條帶進(jìn)行分析

注意事項

1． 本產(chǎn)品為10次（100載玻片）的操作量

2． 操作時，須戴手套

3． 細(xì)胞培養(yǎng)可使用25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿

4． 滯態(tài)液（Reagent B）為100倍濃縮

5． 使用滯態(tài)液（Reagent B）須注意操作安全，小心謹(jǐn)慎，如果濺于皮膚上，立即用水沖洗，并就醫(yī)處理

6． 使用低滲液（Reagent C）處理細(xì)胞，切莫超過30分鐘時間，否則將導(dǎo)致細(xì)胞破裂

7． 使用固定液（Reagent D 和 F）處理細(xì)胞，可以在4℃冰箱里長達(dá)30分鐘，甚至過夜

8． 載玻片必須非常潔凈，且要冷凍后使用

9． 建議從高處滴落樣品，可以使細(xì)胞染色體舒展開來，便于觀察

10． 上樣后的載玻片可以放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里烘干

11． 除了DAPI染色外，還有許多其它染色，例如，醋酸地衣紅染色（aceto- orcein），福爾根染色（feulgen）、嗜堿性染色（basophilic dye）包括甲苯胺藍(lán)染色（toluidine blue）或亞甲基藍(lán)染色（methylene blue）以及吉姆薩染色（giemsa；G、R、C帶），喹吖因氮芥染色（quinacrine mustard；Q帶），丫啶橙染色（acridine orange；R帶）等

12． DAPI染色人體染色體核型參考圖像及其轉(zhuǎn)換為黑白圖像如下：