冰凍切片組織線粒體膜通道孔（MPTP）熒光（TMRM）檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

冰凍切片組織線粒體膜通道孔（MPTP）熒光（TMRM）檢測(cè)試劑是一種旨在通過四甲基羅丹明甲酯染料，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，一旦釋放到細(xì)胞漿，其熒光性顯著降低，來分析和觀察線粒體膜通道孔活性經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種冰凍組織線粒體（動(dòng)物、人體、昆蟲等）膜通道孔活性的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，分辨率高，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。線粒體膜電位的去極化（depolarization），導(dǎo)致膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性，使之線粒體膨脹（swelling），內(nèi)容物釋放。其中鈣離子過度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細(xì)胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），為羅丹明衍生物陽離子染料，作為電勢(shì)測(cè)定（potentiometric）熒光探針：第一，具有親脂性的； 第二，與線粒體內(nèi)膜負(fù)電極結(jié)合而聚集；第三，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。四甲基羅丹明甲酯進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生四甲基羅丹明。四甲基羅丹明進(jìn)入線粒體后，被線粒體俘獲，呈現(xiàn)強(qiáng)烈熒光。一旦線粒體膜通道孔開放，四甲基羅丹明釋放出來而在胞漿重新分布，其熒光性顯著降低。線粒體內(nèi)熒光的變化，表明膜通道孔的開放狀態(tài)。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 60毫升

染色液（Reagent B） 50微升

稀釋液（Reagent C）  5毫升

產(chǎn)品說明書  1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和組織細(xì)胞染色的容器

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細(xì)胞熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入500微升稀釋液（Reagent C），混勻后，在冰槽里靜置，并標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備5片待測(cè)的厚為10微米的未經(jīng)固著處理的冰凍切片

2． 置于室溫下，小心加上200微升預(yù)冷的清理液（Reagent A），鋪滿整個(gè)切片表面

3． 小心移去切片上的清理液（Reagent A）

4． 小心加上100微升室溫預(yù)熱的染色工作液，鋪滿整個(gè)切片表面

5． 在37℃濕潤(rùn)培養(yǎng)箱里，孵育30至60分鐘（注意：避免液體蒸發(fā)）

6． 小心移去切片上的染色工作液，避免光照

7． 小心加上500微升清理液（Reagent A），鋪滿整個(gè)切片表面

8． 小心移去切片上的清理液（Reagent A）

9． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟7和8一次

10． 放上蓋玻片或封片

11． 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察（定性檢測(cè)）：激發(fā)波長(zhǎng)540nm，散發(fā)波長(zhǎng)580nm――紅色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強(qiáng)

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為50次操作

2． 操作時(shí)，避免污染母液

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． 建議使用新鮮組織（手術(shù)切除后1小時(shí)內(nèi)）制成的冰凍切片

5． 染色前，所有試劑溶液，除染色液（Reagent B）外，需37℃預(yù)熱

6． 建議組織染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析

7． 孵育時(shí)，必須避免光照

8． 本產(chǎn)品友好使用于雙重染色或重疊染色

9． 可以使用±10nm波長(zhǎng)的濾波器

10． 本公司提供膜通道孔抑制劑： 0.2毫摩爾環(huán)胞素A（cyclosporine A）－12226，維護(hù)熒光完整

11． 本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

使用承諾

本公司秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請(qǐng)立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。