細(xì)胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途

細(xì)胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)多肽底物，受到CDK1/CYCLIN B磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光度法測(cè)定其氧化后峰值的變化，以分析細(xì)胞裂解樣品中CDK1/CYCLIN B特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或純化酶樣品中CDK1/CYCLIN B激酶的特異活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶1（cyclin dependent kinase 1；CDK1），又稱(chēng)為細(xì)胞分裂周期蛋白2（cell division cycle2；CDC2）或p34^cdk1，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其為高度進(jìn)化保留的激酶復(fù)合物，成熟促進(jìn)因子（maturation promoting factor；MRF）中的催化亞體，含有297氨基酸，與細(xì)胞周期素B結(jié)合，允許細(xì)胞由G2期進(jìn)入有絲分裂期以及由G1期進(jìn)入DNA合成期，達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂等。其磷酸化目標(biāo)序列為 GGGRSPGRRRRK。基于底物GGGRSPGRRRRK，在ATP的存在下，受到CDK1/CYCLIN B激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶1/細(xì)胞周期素B的特異活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）         毫升

裂解液（Reagent B）         毫升

緩沖液（Reagent C）          毫升

酶促液（Reagent D）          微升

反應(yīng)液（Reagent E）          微升

底物液（Reagent F）         微升

陰性液（Reagent G）          微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)               1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶(hù)自備

CDK1/CYCLIN B激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取65微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入10微升酶促液（Reagent D）

3． 加入10微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入10微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入5微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

四、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入5微升待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

六、 酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動(dòng)96孔板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入xx微升陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動(dòng)96孔板

10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

11． 活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括背景操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

6． 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測(cè)定

7． 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)30分鐘

8． 光度測(cè)定后，比色皿須清洗

9． 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

11． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

12． 可以使用CDK1/CYCLIN B抑制劑（CGP74514A）作為抑制劑對(duì)照（IC50＝0.025微摩爾）或陰性對(duì)照

13． CDK1/CYCLIN B激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位

14． 本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品