精子活力和頂體反應(yīng)三色（triple staining）染色試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）
主要用途
精子活力和頂體反應(yīng)三色（triple staining）染色試劑是一種旨在使用臺(tái)盼藍(lán)、孟加拉紅和俾斯麥棕Y三種染料特異性著色死亡精子、完整頂體以及頂體后區(qū)，產(chǎn)生藍(lán)、紅棕色，從而確定細(xì)胞活力以及精子功能（頂體反應(yīng)）的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種動(dòng)物或人體精子細(xì)胞。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)便，性能穩(wěn)定，著色清晰。
技術(shù)背景
在學(xué)（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子壽命、以及生育能力的基礎(chǔ)信息。其中精子的活力（vitality）、運(yùn)動(dòng)能力（motility）、授精潛力（fertilizing potential）、膜結(jié)構(gòu)完整性（integrity）、頂體反應(yīng)（acrosomal reaction）功能的評(píng)價(jià)是精子分析的重要指標(biāo)，也是決定人工受孕或體外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要參數(shù)。其中頂體反應(yīng)，是指當(dāng)精子接近卵子實(shí)施授精時(shí)，精子頭部前半端的帽狀結(jié)構(gòu)頂體，釋放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。頂體反應(yīng)測(cè)試是一項(xiàng)穩(wěn)定的精子功能參數(shù)，可以用于預(yù)測(cè)受精成功率。因此頂體的結(jié)構(gòu)完整性（intact）是評(píng)價(jià)的主要標(biāo)志，也是不育癥和藥物研究的對(duì)象。三色（triple staining）染色首先使用臺(tái)盼藍(lán)（trypan blue）染色，分析精子活力，基于臺(tái)盼藍(lán)受到活體精子細(xì)胞（包括游動(dòng)性和非游動(dòng)性精子）的排斥，而死亡精子細(xì)胞攝入染料顯示紅色的原理。其次使用孟加拉紅或虎紅（Rose Bengal）染料與頂體內(nèi)含物的結(jié)合，區(qū)別完整性（未反應(yīng)性u(píng)nreacted）頂體，以及俾斯麥棕Y（Bismark Brown Y）染料識(shí)別頂體后區(qū)（post-acrosomal region）染色。通過(guò)常用的一般光學(xué)顯微鏡（無(wú)需相差顯微鏡；phase-contrast microscope）便可清晰觀察到頂體缺失狀態(tài)。
產(chǎn)品內(nèi)容
一染液（Reagent A） 毫升
清理液（Reagent B） 毫升
固定液（Reagent C） 毫升
二染液（Reagent D） 毫升
三染液（Reagent E） 毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書 1份
保存方式
保存在4℃冰箱里，避光，有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：用于細(xì)胞計(jì)數(shù) 1
蓋玻片：用于精子細(xì)胞爬片
一般光學(xué)顯微鏡：用于觀察染色的精子細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)步驟
1． 移取新鮮獲得的精液（30分鐘至1小時(shí)內(nèi)）到1.5毫升離心管
2． 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育30分鐘
3． 輕柔渦旋震蕩5秒
4． 移取xx微升上述精液到新的1.5毫升離心管
5． 加入xx微升一染液（Reagent A）
6． 用200微升槍頭上下抽吸混勻
7． 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育15分鐘
8． 即刻移取xx微升到潔凈的載玻片
9． 蓋上蓋玻片
10．即刻在一般光學(xué)顯微鏡下（1000倍；即油鏡下）觀察并計(jì)數(shù)（注意：每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)精子）
藍(lán)色染色的精子細(xì)胞為死亡細(xì)胞，而不染色的精子細(xì)胞為活體細(xì)胞
11．將1.5毫升離心管放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
12．小心抽掉上清液
13．加入xx微升清理液（Reagent B），混勻
14．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
15．小心抽掉上清液
16．加入xx微升固定液（Reagent C），混勻
17．室溫下孵育60分鐘
18．放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
19．小心抽掉上清液
20．加入xx微升清理液（Reagent B），混勻
21．即刻移取12微升到潔凈的載玻片一端
22．用蓋玻片或另一個(gè)載玻片推片
23．置于空氣中涼干
24．小心加上xx微升二染液（Reagent D）在載玻片上，覆蓋樣品表面
25．放進(jìn)40℃恒溫培養(yǎng)箱孵育5分鐘
26．即刻移去二染液（Reagent D）
27．小心加上xx微升清理液（Reagent B）在載玻片上，覆蓋樣品表面
28．即刻移去清理液（Reagent B）
29．小心加上xx微升三染液（Reagent E）在載玻片上，覆蓋樣品表面
30．室溫下孵育30分鐘
31．即刻移去三染液（Reagent E）
32．小心加上xx微升清理液（Reagent B）在載玻片上，覆蓋樣品表面
33．即刻移去清理液（Reagent B）
34．封片
35．即刻在一般光學(xué)顯微鏡下（1000倍；即油鏡下）觀察并計(jì)數(shù)（注意：每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)精子）
粉紅色頂體和淺棕色頂體后區(qū)――活體精子未反應(yīng)完整頂體
無(wú)色頂體和淺棕色頂體后區(qū)――反應(yīng)后頂體（或頂體缺失）――陽(yáng)性頂體反應(yīng)
藍(lán)色精子細(xì)胞、粉紅色頂體和淺棕色頂體后區(qū)――死亡精子未反應(yīng)完整頂體
無(wú)色頂體和無(wú)色頂體后區(qū)――死亡或凍存后、損傷后精子退化頂體（或頂體缺失）
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為50次操作
2． 操作時(shí)須戴手套
3． 樣品檢測(cè)前，建議在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)觀察精子游動(dòng)
4． 精子細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)乘上稀釋倍數(shù)104。標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（Hemocytometer）的計(jì)算方法是：
1毫米方塊的細(xì)胞計(jì)數(shù)X 104（稀釋倍數(shù)）＝實(shí)際細(xì)胞數(shù)/毫升
5． 避免一染液（Reagent A）染色時(shí)間超過(guò)15分鐘，否則由于其毒性導(dǎo)致精子細(xì)胞死亡
6． 本產(chǎn)品可用于染色稀釋過(guò)的或凍存過(guò)的精子細(xì)胞
7． 本公司提供系列發(fā)育生物學(xué)相關(guān)檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定著色清晰